実験プロトコール

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製品カタログ（目的別）

実験プロトコール目次

プロトコールタイトル

関連する調製方法 SDS-PAGE用ポリアクリルアミドゲル作製

プロトコール概要

SDS-PAGE電気泳動に用いるゲルは、基本的に上段がスタッキングゲル（stacking gel; 濃縮ゲル）、下段がランニングゲル（running gel; 分離ゲル）と呼ばれる2層のポリアクリルアミドゲルから構成されます。ランニングゲルは濃度を変えることで分離できるタンパク質の分子量が異なります。

使用する物質

使用する試薬	製品例	必要量	注意事項
SDS-PAGEポリアクリルアミドゲル調製用試薬			「ポリアクリルアミドゲル調製試薬」の項目を参照
ゲル作製装置
N,N,N｡ﾇ,N｡ﾇ-テトラメチルエチレンジアミン (TEMED)	T9281

手順

手順	内容
補足	使用するアクリルアミド溶液の量は目的のゲル濃度によって異なります。ここでは例として10%のアクリルアミドゲルの調製手順を示します。溶液A～Eは「ポリアクリルアミドゲル調製試薬」の項目を参照。
手順1	使用している装置の説明書に基づいて、ゲル作製用のガラス板を組み立てます。タンパク質の混入がないように、ガラス板などは70%エタノールでよく拭きます。
手順2	ランニングゲル溶液を次のように調整します（10%, 20 ml用）。　溶液A（アクリルアミド溶液）6.67 ml + 溶液B（1.5 M Tris溶液）5.0 ml + 溶液D（10%SDS溶液）0.2 ml + 溶液E（10%過硫酸アンモニウム溶液）0.1 ml + 純水 8.0 mlをやや大きめの三角フラスコまたはビーカーに入れ、泡立たないように均一に混ぜます。
手順2（補足）	容器の底を実験机につけながらゆるやかに回すと、泡立ちにくく混ぜ合わせられます。
手順3	スタッキングゲル溶液を次のように調整します（4.5%, 10 ml用）。　溶液A（アクリルアミド溶液）1.5 ml + 溶液C（0.5 M Tris溶液）2.5 ml + 溶液D（10%SDS溶液）0.1 ml + 溶液E（10%過硫酸アンモニウム溶液）50 μｌ + 純水 5.85 mlをやや大きめの三角フラスコまたはビーカーに入れ、手順2と同様に泡立たないように均一に混ぜます。
手順4	アスピレーターを使用して2と3の溶液を脱気します（気泡が出なくなるまで）。
手順4（注意）	アクリルアミドの重合は酸素によって阻害されますので、アクリルアミド溶液は十分に脱気します。
手順5	ランニングゲル溶液に14 μｌのTEMEDを加え、泡立たないように手早く混ぜます。
手順6	手順5の溶液をできるだけ早くゲル板に泡立たないように静かに適量を流し入れます（ゲル板を傾けながら流し入れます）。
手順6（補足）	入れる量は使用するコームのサイズによって異なります。溶液を入れる前にコームが届く位置を確認し、コームの先端から1 cm程度下のラインまでゲル溶液を流し入れます。
手順7	ゲル板を垂直に立て、マイクロピペットまたはシリンジを使用して純水をゆっくりと重層させ、30分間以上静置してゲルが固まるのを待ちます。
手順8	ゲルが固まったら、重層していた水を捨てます（デカントで捨て、付着した水はキムワイプで吸い取ります）。
手順9	手順4で脱気済みのスタッキングゲル溶液に7 μｌのTEMEDを加え、泡立たないように手早く混ぜます。
手順10	スタッキングゲル溶液をできるだけ早くゲル板に泡立たないように静かに流し入れ（ゲル板を傾けながら入れます）、コームを差し込みます。
手順11	ゲルが固まるまで静置します。ゲルが乾燥しないようにゲル板の上部をラップで覆います。
手順12	完成したゲルは当日または翌日までに使用します。

手順のリンク

プロトコール注意事項

アクリルアミドは有害性がありますので、手袋など保護具を着用して取り扱って下さい。ゲルにタンパク質などが混入しないように手袋をしてゲルを取り扱って下さい。

プロトコールオプション

ランニングゲルの濃度を変える場合は、溶液A（アクリルアミド溶液）の量を濃度に比例して変更し、最後に水の量を算出します。スタッキングゲルの濃度は基本的に一定です。