| 手順 | 内容 |
| SDS-PAGE1 | 高〜低分子量のタンパク質に対して、10〜20%のアクリルアミドゲルを使用してSDS-PAGE（カセットサイズ約80×80mm）を行います。分析用の場合は、0.5〜10μg/wellのタンパク質をアプライします；調製用の場合は、1枚のゲルあたり600〜800μgの全細胞もしくは組織ホモジネートをアプライします。分子量マーカーを1レーンアプライします。 |
| タンパク質のブロッティング1 | 転写用のバッファーとしてバッファー1（0.3 M Tris, 20% メタノール, pH 10.4）、バッファー2（0.025 M Tris, 20% メタノール, pH 10.4）、バッファー3（0.02 M Tris, 20% メタノール, 5.25mg/mL 6-アミノカプロン酸, pH 10.4）、をそれぞれ500 ml準備します。 |
| 補足 | バッファー1は18.2 gのトリス塩基（Tris Base; Trizma Base, 分子量121.14）を400 mlの水で溶かし、100 mlのエタノールを加えます。用時調製または前日に調整。 |
| 補足 | バッファー2は1.5 gのトリス塩基（Tris Base; Trizma Base, 分子量121.14）を400 mlの水で溶かし、100 mlのエタノールを加えます。用時調製または前日に調整。 |
| 補足 | バッファー3は1.2 gのトリス塩基（Tris Base; Trizma Base, 分子量121.14）と2.6 gの6-アミノカプロン酸（6-Aminocaproic acid; ε-Aminocaproic acid）を400 mlの水で溶かし、100 mlのエタノールを加えます。用時調製または前日に調整。 |
| タンパク質のブロッティング2 | 電気泳動が終わったゲルを取り出し、バッファー3を適量入れたタッパーに移し入れます。 |
| タンパク質のブロッティング3 | バッファー1に2枚のろ紙（重ねた状態）を軽く浸し、ブロッティング装置（陰極側のプレート上）に乗せます。 |
| 注意 | ブロッティング装置の陰極・陽極を確認して下さい。タンパク質は陰極から陽極側に移動しますので、ゲルが陰極側・膜が陽極側になるようにセットします。 |
| タンパク質のブロッティング4 | バッファー2に2枚のろ紙（重ねた状態）を軽く浸し、3のろ紙の上に重ねます。 |
| タンパク質のブロッティング5 | バッファー2にニトロセルロース膜を軽く浸し、手順4のろ紙の上に重ねます。 |
| 補足 | PVDF膜を使用する場合は、最初にメタノールに浸してからバッファー2で15分間以上振とうしておきます。 |
| タンパク質のブロッティング6 | 手順2のゲルを手順5のニトロセルロース膜の上に重ねます。 |
| 補足 | 乗せたゲルの角の位置を膜上にボールペンなどで印をつけておくと、泳動したレーンの確認に便利です。また、バッファーに浸す前に、メンブレンの一箇所の角を少し切り落としておくと、メンブレンの方向を確認しやすくなります。 |
| 注意 | ゲルと膜の間に気泡が入らないように気をつけて下さい。気泡が入っている場合は、軽くゲルを押して泡を外に出すようにして下さい。 |
| タンパク質のブロッティング7 | バッファー3に2枚のろ紙（重ねた状態）を軽く浸し、手順6のゲルの上に重ねます。 |
| タンパク質のブロッティング8 | 90 mAで1.5時間通電します。 |
| タンパク質のブロッティング9 | ブロッティング終了後、膜を取り出しPBSまたはTBS溶液の入ったタッパーに移します。 |
| ブロッキング1 | 引き続き免疫染色を行う場合は、9のタッパーからPBSまたはTBSを捨て、ブロッキングバッファー（5% BSA, TBS溶液）を入れ、振とうしながら2時間〜一晩インキュベート（室温または4℃）します。 |
| 補足 | ブロッキングを行うことで膜をマスキングして非特異的な結合を抑える作用があります。 ブロッキング剤にはスキムミルク（Skim Milk; Nonfat-Dried Milk）を用いることもできます。ただし、抗体やサンプルによっては適さないブロッキング剤もありますので、その場合は条件を検討する必要があります。 |
| ブロッキング2 | ブロッキング溶液を捨て、適量のTBSで膜を洗浄します（5分間振とうを1回）。 |
| 抗体反応1 | TBSを捨て、最適な濃度に調整した一次抗体溶液を加え、1〜3時間室温でゆるやかに振とうしながらインキュベートします。 |
| 注意 | 抗体の希釈率は、抗体の種類やロット、サンプルの種類や量、検出方法によって異なります。初めて使用する抗体や同じ抗体でもロットが異なる場合は、様々な抗体希釈液を調製して同じサンプルに対して免疫染色を行うことで適した抗体濃度を検討する必要があります。 |
| 補足 | 抗体の希釈にはTBS-Tが用いられますが、バックグランドを低減させるためにブロッキング溶液（ブロッキング剤を含むTBS溶液）を使用することもできます。 |
| 抗体反応2 | 抗体液を捨て、膜をTBS-T（TBS/Tween 20）で洗浄します（5分間振とうを3回繰り返す）。 |
| 抗体反応3 | TBS-Tを捨て、適した濃度に希釈した二次抗体溶液を入れ、1時間ゆるやかに振とうしながらインキュベートします。 |
| 抗体反応4 | 抗体の希釈にはTBS-Tが用いられますが、バックグランドを低減させるためにブロッキング溶液（ブロッキング剤を含むTBS溶液）を使用することもできます。 |
| 抗体反応5 | 二次抗体溶液を捨て、抗体液を捨て、膜をTBS-T（TBS/Tween 20）で洗浄します（5分間振とうを3回繰り返す）。 |
| 抗体反応6 | 抗体に標識されている酵素や蛍光色素に応じて検出を行います。 |
| 参考文献1 | Burnette, W.N., Anal. Biochem., 112, 195-203 (1981) |
| 2 | Hames, B.D., and Richwood, D .(eds.), Gel Electrophoresis of Proteins: A Practical Approach, IRL Press Ltd., Oxford (1981) |
| 3 | Gershoni, J.M., and Palade, G. E., Anal. Biochem., 131, 1-15 (1983) |
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